Gram-festés. Mikropreparátumok festése

A Gram-módszerrel festőképességük szerint minden ismert baktérium pozitív és negatív csoportra osztható. Ez a felosztás a sejtfaluk szerkezeti jellemzőitől és színétől függ.

A módszer lehetővé teszi az összes típus felosztását a mikroorganizmus sejt külső héjának szerkezetének sűrűségétől függően:

• ellenállóbb az ütésekkel szemben környezet, az antibiotikumok hatása;
• kevésbé stabil.

Robert Koch volt az első tudós, aki felvetette, hogy egyes korábban csak a botanikában használt módszerek alkalmazhatók a mikrobiológiában.

1884-ben Christian Gram, a szövetfestésre szakosodott dán biológus először próbálta ki a differenciálfestési módszert.

A felfedezés lehetővé tette az összes létező mikroorganizmus típus Gram-pozitívra és Gram-negatívra történő felosztását, ami lendületet adott a tudomány fejlődésének új szakaszához ezen a területen. mikrobiológiai kutatás. Lehetővé tette továbbá a kórokozó fajok gyógyszerekkel szembeni rezisztenciájának azonosítását, viselkedésük előrejelzését, és ami a legfontosabb, az antibiotikumok új generációjának kifejlesztését, amely képes legyőzni a betegséget.

A sejtfal szerkezete

Bármely baktérium héja egy speciális anyagból - mureinból áll. Molekulája párhuzamosan elhelyezkedő poliszacharidok lánca. A poliszacharidokat viszont keresztben elhelyezkedő aminosavláncok kötik össze.

Ez a kapcsolat határozza meg a héj szilárdságát, rugalmasságát, alakját. Egyfajta szövött háló védi a mikroorganizmus belső rétegét a pusztító tényezők hatásától, megakadályozza a víz bejutását. Ugyanakkor a láncok közötti rések lehetővé teszik a sejt számára a tápanyagok felszívódását, például a pórusokat.

A Gram-pozitív mikroorganizmusokban a héj vastagabb, erősebb, mivel összetételében fehérje szerepel.

Negatív fajokban a sejtmembrán szerkezete sokkal bonyolultabb, ami lehetővé teszi, hogy megvédjék az olyan közegek hatásától, mint a nyál, a gyomornedv és más, antibakteriális tulajdonságokkal rendelkező lizozimot tartalmazó folyadékok. Kívül egy vékonyabb héjat lipidekből és poliszacharidokból álló film veszi körül - egy sima felületi réteg.

A Gram-módszer lényege

A Gram-módszer alapja az az elve, hogy a baktériumokat a mikroorganizmusok sejtfalának eltérő kémiai összetétele alapján a Gram szerint "plusz" és "mínusz" jelű mikroorganizmusokra osztják.

A Gram-pozitív és Gram-negatív baktériumok meghatározásához az üvegre vékony, egyenletes rétegben felvitt készítményt először égő feletti hevítéssel rögzítjük. Ezután festett anilin festékkel - metilibolya. Ezután jóddal rögzítjük, hagyjuk megszáradni és alkohollal lemossuk.

• A Gram-pozitív (Gram +) fajok élénkkék színűvé válnak.
• A Gram-negatív (Gram-) baktériumok elszíneződnek.

Az utolsó lépés a készítmény megfestése vörös kontrasztfestékkel, amely lehetővé teszi a vörös vagy rózsaszín színű gram-negatív mikroorganizmusok előállítását. Ennek az az oka, hogy a festék vastag külső rétege miatt nem tud behatolni a sejtbe, csak a felületet festi meg.

Az elhalt mikrobák világosabb színt kapnak, mint az élő mikrobák.

Gram-pozitív baktériumok jellemzése

A legtöbb Gram-pozitív baktérium patogén az emberre. Ezek a veszélyes betegségek kórokozói:

1. Streptococcus (Streptococcus), mandulagyulladást, garatgyulladást, reumát okoz.
2. Staphylococcus (Staphylococcus) - a vérmérgezés, a bőr gennyes betegségeinek kórokozója.
3. A listeria, amely a listeriózist okozza, az agy gyulladása.
4. Bacillusok (Bacillus) - toxikológiai fertőzések, lépfene okozói.
5. Clostridium (Clostridium), botulizmust, tetanust, gáz gangrénát okoz.

Az utolsó két faj spóraképző anaerob, a többi nem tud spórát képezni. Néhányuk csak az aktív növekedési fázisban képes festeni.

Gram-negatív baktériumok

Ezek olyan baktériumok, amelyek alkoholos mosás után teljesen elszíneződnek; a szafraninnal történő újrafestés következtében rózsaszínűvé vagy élénkpirossá válnak. Ellenállóbbak az antitestekkel szemben, mint a Gram+ fajok.

A Gram-negatív baktériumok főként opportunista kórokozók, amelyek okozhatnak gyulladásos folyamatokés immunválasz az emberi szervezetben bizonyos körülmények között. Lipopoliszacharid rétegből álló sejtmembránjuk citokinek szintézisét idézi elő, ami hozzájárul a gyulladás helyén a toxinok növekedéséhez. Ezt követően a vérárammal együtt szállított méreganyagok okozzák a mérgező hatású mérgezés legerősebb tüneteit.

A Gram-módszer fontos szerepe a betegségek diagnosztizálásában

Egy olyan módszer, amely lehetővé teszi a Gram-pozitív és a negatív baktériumok megkülönböztetését, elengedhetetlen az emberi biológiai anyagok tanulmányozásában a bakteriális fertőzés kimutatására.

A diagnózishoz használt anyagok:

• a köpet lehetővé teszi a nasopharynx mikroflórájának összetételének osztályozását, a kórokozók kimutatását;
• a széklet elemzése során kimutatják a gram-pozitív fajok által termelt toxinokat;
• a hüvelykenet lehetővé teszi a gram-negatív és pozitív mikrobák százalékos arányának kiszámítását a bakteriális hüvelygyulladás diagnosztizálásához;
• a pleurális, ízületi, perinatális folyadékok is meglehetősen informatívak.

A Christian Gram által bevezetett módszer lehetővé tette, hogy a tudomány messzemenően előrehaladjon a mikrobák szerkezetének, védekező mechanizmusainak ismeretében. Lehetővé tette a baktériumok pozitív és negatív felosztásának legpontosabb rendszerének bevezetését, amelyet ma is használnak a fertőző betegségek diagnosztizálására.

A mikrobiológiai gyakorlatban legszélesebb körben alkalmazott Gram-festés komplex módszere (amelyet először 1884-ben H. Gram dán tudós javasolta). A módszer az egyik legfontosabb azonosítási jellemző a baktériumok típusának meghatározásában.

A Gram-festési módszer lényege, hogy minden baktériumot két csoportra osztanak aszerint, hogy mennyire képesek festékekkel festeni (enciánibolya vagy kristályibolya jóddal). Az egyik csoportba azok a baktériumok tartoznak, amelyek sejtjeiben alkoholos kezelést követően megmarad az ezekből a színezékekből képzett komplex. Az ilyen sejtek a festés következtében sötétlila színt kapnak, és gram-pozitívnak (gram +) nevezik. Például spóraképző baktériumok - Bacillus, Clostridium, a nem spóraképzők közül - Lactobacillus, Micrococcus, Staphylococcus, Sarcina, Leuconostok stb.

Egy másik csoportba azok a fajok tartoznak, amelyek nem képesek megtartani a színező komplexumot, és alkohollal kezelve elszíneződnek. Gram-negatívnak (gram-) nevezik. Köztük sokféle nem spóraképző rúd alakú baktérium található, pl. nemzetségek Pseudomonas, Escherichia, Salmonella, Proteus stb.

A sejtek azon képessége vagy képtelensége, hogy megtartsák a festőkomplexet, jelenleg összefüggésbe hozható kémiai összetételés a bakteriális sejtfalak szerkezete. A gram + baktériumok héja több murein-glikopeptidet, poliszacharidokat és teichoinsavat tartalmaz. Meglehetősen sűrű többrétegű szerkezetük van. A Gram+ baktériumsejtekben az enciánibolya és a jód erős kötést képez a citoplazmával, amelyet alkohol nem von ki. Megtartják az enciánibolya ibolya színét és további Pfeiffer magenta festéssel.

A grambaktériumok héja egyrétegű, magas lipidtartalommal rendelkeznek lipoprotidok és lipopoliszacharidok formájában. A Gram-baktériumok alkohollal történő kezelés hatására színtelenné válnak, mert enciánibolyájuk nem rögzül a citoplazmában. További fukszin festéssel a baktériumsejtek csak halvány rózsaszín színűek.

A Gram+ nem csak a színhez való viszonyukban különbözik a gram-tól, hanem számos biológiai tulajdonságban és tulajdonságban is. A legtöbb gram+ faj fokozottan ellenáll a kiszáradásnak, a hőkezelésnek, a radioaktív és más típusú sugárzásoknak. Ugyanakkor a grambaktériumok jobban ellenállnak a lúgok és a proteolitikus enzimek, valamint az antibiotikumok hatásának.

A Gram-festést az élelmiszerek idegen eredetű szennyezettségének mértékének meghatározására használják, beleértve a szennyeződést. feltételesen patogén (bélcsoport) mikroflóra, az antibiotikumok hatástartományának meghatározására és egyéb célokra. Nem szabad megfeledkezni arról, hogy bizonyos típusú baktériumok, mivel fiatal korukban Gram +, a régi tenyészetekben nem mindegyik festődik intenzíven Gram-festéssel. Emiatt a festéshez egy- vagy kétnapos tenyészeteket kell venni, ezen kívül az összehasonlításhoz kontrolltenyészeteket (standardokat) kell használni, amelyek kapcsolata a Gram-festéssel előre ismert.

A Gram-festés a következőképpen történik:

1. Egy tárgylemezen három baktériumtenyészetből készült kenet készül: ismert Gram-pozitív, kutatott és ismert Gram-negatív.

2. A keneteket megszárítjuk és lánggal rögzítjük.

3. Festesd meg enciánibolya karbolos oldatával 1-2 percig.

4. A festéket lerázással eltávolítjuk, a kenetekre Lugol-oldatot (J és KJ oldat) viszünk fel és 1-2 percig inkubáljuk. amíg a kenet fekete nem lesz.

5. A Lugol oldatot lecsepegtetjük, néhány csepp 96%-os alkoholt csepegtetünk a készítményre, és az üveget enyhén megrázva tartsuk addig, amíg a kenet kitisztul. (20-30 mp).

A készítményt azonnal vízzel mossuk. A teljes festés eredménye a kenet alkoholos kezelésétől függ: elégtelen kezelés esetén minden baktérium megtartja a festést, túlzott kezelés esetén minden sejt elszíneződik.

6. Ezenkívül festse meg a készítményt Pfeiffer fukszinnal (hígított fukszin) 2 percig.

7. A festéket lemossuk, a készítményt megszárítjuk és a 90-es évek merülőlencsével szemléljük.

A készítmény helyes elkészítése esetén a látómezőben gram+sötétlila sejtek, mellettük jól láthatóak a halvány rózsaszín gramsejtek.

A bakteriológia fő festési módszere a Gram-festés. Gram-festéssel kezdődik a morfológiai tulajdonságok leírása. Ennek a módszernek a jelentősége abban rejlik, hogy a baktériumsejt Gram-festése függ a sejtfal szerkezetének típusától, és ennek megfelelően attól, hogy a Firmicutes vagy Gracilicutes osztályba tartozik-e - ez az első szakasz bármely sejt azonosításában. fajok a bakteriológiában. A Gram-festés négy lépésben történik.
V. Első lépésben a rögzített kenetet enciánibolyával megfestjük.

1. A színezés 1-2 percig tart.
2. Ezzel a festékkel a Gram-pozitív és Gram-negatív baktériumok is kékre festenek.
B. A második szakaszban a kenetet Lugol-oldattal kezeljük, amely a citoplazmatikus membránon lokalizált enciánibolyával színező komplexet képez.
1. A Lugol-oldattal végzett kezelés 1-2 percig tart.
2. Ebben a szakaszban a Gram-pozitív és Gram-negatív baktériumok is kékek maradnak.
B. A harmadik szakaszban a kenetet alkohollal elszínezzük.
1. Az alkoholos fehérítés körülbelül 20 másodpercig tart, majd bőséges öblítés következik vízzel.
2. A Gram-pozitív baktériumoknak ez idő alatt nincs idejük elszíneződni és kékek maradnak, míg a Gram-negatív baktériumoknak a vékonyabb peptidoglikán réteg miatt, amely megakadályozza, hogy az alkohol kimossák a festőkomplexet, lesz idejük elszíneződni, és ezért színtelenné válik.
D. A negyedik szakaszban a kenetet vízbíborral vagy más vörös festékkel - szafraninnal - megfestik.
1. A vörös festékkel végzett festés 1-2 percig tart. Sőt, jobb ezt a szakaszt hosszabbra meghosszabbítani, mivel a fehérítés után a baktériumsejtfal a szokásosnál rosszabbul érzékeli a festéket.
2. A Gram-pozitív baktériumok kékek maradnak, mivel már sötétebb festékkel festődnek, míg a Gram-negatív baktériumok, amelyek az előző szakaszban elszíneződtek, ebben a szakaszban vörösre festődnek. E. A Gram-pozitív baktériumok az orvosi mikrobiológia által vizsgált baktériumok kisebb részét alkotják. Alább láthatók a főbbek (ezt a listát később a nem spóraképző anaerobok egészítik ki).
1. Gram-pozitív a coccusok többsége (a Neisseria kivételével): staphylococcusok, streptococcusok és pneumococcusok, enterococcusok.
2. Gram-pozitív pálcikák a listeria, az aktinomyceta-sorozatba tartozó baktériumok (actinomycetes, mycobacteriumok, corynebacteria), spóraképző pálcikák (bacillusok és clostridiumok).
E. A legtöbb baktérium, amely orvosi jelentősége, Gram-negatív. Csak a mikoplazmákkal kapcsolatban nem helyes Gram-negatívságukról beszélni (bár Gram szerint rózsaszínre festenék őket, ha így festenék őket, mivel a gyakorlatban ezt a módszert nem alkalmazzák a mikoplazmák vizsgálatában). A helyzet az, hogy a Gram-pozitív és Gram-negatív baktériumok a sejtfal típusában (elsősorban a benne lévő peptidoglikán mennyiségében) különböznek egymástól, míg a mikoplazmáknak nincs peptidoglikánt tartalmazó sejtfaluk.
1. Gram-negatív cocci - Neisseria.
2. A legtöbb pálca gram-negatív (valójában mindegyik, a fent felsorolt ​​gram-pozitívak kivételével).
3. A gram-negatív típusú sejtfalban is vannak spirocheták.

(vagy Gram módszer)- empirikusan levezetett módszer a baktériumok megkülönböztetésére úgy, hogy bizonyos módszerrel festik őket két nagy csoportra: Gram-pozitívra és Gram-negatívra, amelyek sejtfaluk kémiai és fizikai tulajdonságaiban különböznek egymástól.

Etimológia

A módszer nevét feltalálójáról, Hans Christian Gram (1853-1938) dán tudósról kapta, aki 1884-ben fejlesztette ki a módszert a baktériumok megkülönböztetésére. PneumococcusÉs Klebsiella pneumoniae.

Használat

A Gram-festés az egyik leghasznosabb festési eljárás a mikrobiológiai laboratóriumi kutatásokban. Az eljárást széles körben használják eszközként a Gram-negatív és Gram-pozitív baktériumok megkülönböztetésére, általában az első lépés egy adott baktériumminta azonosságának meghatározásában.

Az orvostudományban a Gram-festést vérvizsgálattal vagy biopsziával végzik, ha fertőzés gyanúja merül fel. Ez a módszer sokkal gyorsabb, mint a tenyésztés, és különösen fontos, amikor a fertőzés típusának meghatározása szükséges a prognózishoz és a kezelés megválasztásához. Például a cerebrospinális folyadék agyhártyagyulladás és az ízületi folyadék szeptikus ízületi gyulladás diagnosztizálása során.

Elemezve például a Koki és a baktériumok spórát hordozó formái, valamint az élesztőgombák Gram-pozitívak és kékesfeketére (sötétkékre) festenek, a legtöbb más baktérium Gram-negatív és vörösre fest, az eukarióta sejtmagok pedig fényesek lesznek. piros, a citoplazma pedig rózsaszín.

Festési technika

A Gram-festés egy összetett festési módszerre utal, amelyben a kenetet két folt érinti, amelyek közül az egyik az elsődleges, a másik pedig egy másodlagos festés. A színezékek mellett összetett színezési módszerekkel kéregtelenítő anyagokat is használnak: alkoholt, savakat stb. A Gram-festéshez gyakrabban használják a trifenil-metán csoportba tartozó festékeket: encián, metilibolya vagy kristályibolya. A Gram-pozitív (gram (+)) mikroorganizmusok erős kapcsolatot adnak a jelzett festékekkel és jóddal. Ugyanakkor alkoholnak kitéve nem színeződnek el, aminek eredményeként a fukszin Grammal (+) történő további festéssel a mikroorganizmusok nem változtatják meg az először kötött lila színt.

A gram-negatív (-) mikroorganizmusok bázikus színezékekkel és jóddal vegyületeket képeznek, amelyeket az alkohol könnyen elpusztít. Ennek eredményeként a mikrobák elszíneződnek, majd bíborvörösre festődnek, és vörös színt kapnak.

Anyag előkészítése festéshez

A vizsgált anyagot vékony rétegben eloszlatjuk egy jól zsírtalanított üveg felületén. Az elkészített kenetet levegőn szárítjuk, és a teljes száradás után rögzítjük.

Rögzítés

A rögzítés során a kenet az üvegfelületen rögzítésre kerül, ezért a készítmény további festése során a sejtek nem mosódnak le. Ráadásul az elölt mikrobasejtek jobban festődnek, mint az élők. Létezik egy fizikai rögzítési módszer, amely a magas hőmérsékletnek a sejtre gyakorolt ​​hatásán alapul, és kémiai módszerek, amelyek a citoplazmatikus fehérjék koagulációját okozó vegyszerek alkalmazását jelentik.

Fizikai rögzítési mód Üveg a gyógyszert csipesszel kell bevenni, és 2-3 alkalommal simán mozgatni az égő lángjának felső részén. A teljes rögzítési folyamat nem tarthat tovább 2 másodpercnél. A rögzítés megbízhatóságát egy ilyen technikával ellenőrzik: a kenettől mentes üvegfelületet a bal kéz hátsó felületére visszük fel. Megfelelő rögzítés esetén az üvegnek forrónak kell lennie, de nem éghet (70-80°C).

Kémiai rögzítés For A keneteket metil-alkohollal, acetonnal, Nikiforov keverékével (96% etil-alkohol és érzéstelenítő észter keveréke 1:1 arányban), Carnoy folyadékkal (96% - 60% etil-alkohol, 30% kloroform, jégecet keveréke) rögzítik. sav 10%). A megszáradt kenettel ellátott poharat 10-15 percre fixálószeres főzőpohárba merítjük, majd levegőn szárítjuk.

Színezési folyamat

1. Az egyik fő festéket egy fix kenetre öntjük 2-3 percig. A csapadék elkerülése érdekében szűrőpapíron kell átfesteni.
2. Engedje le a festéket, óvatosan távolítsa el a szűrőpapírt. A kenetet 1-2 percig Gram szerint Lugol-oldattal vagy jódoldattal (kálium-jodid és kristályos jód 2:1 arányú vizes oldata) öntjük a készítmény megfeketedésére.
3. Az oldatot lecsepegtetjük, a kenetet 96°-os etil-alkohollal vagy acetonnal öblítjük, öntjük és ürítjük addig, amíg a kenet NEM elszíneződik, és a folyadék tiszta lesz (kb. 20-40-60 másodperc).
4. Alaposan öblítse le a tárgylemezeket folyó vagy desztillált vízben 1-2 percig.
5. A gram-negatív baktériumok kimutatására a készítményeket fukszinnal vagy szafraninnal festik (2-5 perc).
6. Öblítse le folyó vízben, és szárítsa meg szűrőpapírral.

Workshop: Élő (natív) és festett mikrobák mikroszkópos vizsgálata.

Mikroszkópos módszer a mikrobiológiában. Módszertani alapok.

Mikroszkópia fényoptikai mikroszkópban.

A fénymikroszkóp mechanikai és optikai részekből áll. A mikroszkóp mechanikus része egy talpból és oszlopból álló állvány, amelyhez egy cső és egy tárgyasztal csatlakozik. Az oszlop két csavarrendszerrel rendelkezik a cső rögzítéséhez. A mikroszkóp optikai része egy világító berendezésből, objektívekből és szemlencsékből áll. A világítóberendezés a tárgyasztal alatt található. A legtöbb mikroszkópban a fény a tükörről visszaverődik, és a gyűjtőlencsén áthaladva a készítmény síkjába fókuszál. A modern mikroszkópokban a megvilágítást a mikroszkópba épített fényforrással érik el. A lencsék egy fémkeretben lévő lencserendszer. Az elülső (frontális) lencse a legkisebb. A mikroszkóp nagyítása elsősorban attól függ. A mögötte elhelyezett lencséket korrekciós lencséknek nevezzük, mivel az optikai kép tökéletlenségeit hivatott kiküszöbölni. A mikroszkópos vizsgálat során a lencsét egy csepp olajba merítik, ezért a lencsét immerziós lencsének (lat. immercio - immerzió), az olajat pedig immerziós olajnak nevezik. Az immerziós objektív különös gondosságot igényel. A frontális lencse olyan rövid gyújtótávolsággal rendelkezik a vizsgált tárgyhoz képest, hogy a lencsét lassan, oldalról nézve kell leengedni, nehogy összetörje a preparátumot, ami a lencse károsodásával jár. A szemlencséknek két lencséje van: a felsőt szemlencsének, az alsót pedig gyűjtőlencsének nevezik. A szemlencséket az általuk adott nagyítás jelöli ki, például: x7, x10, x15 stb. Az optikai mikroszkóp felbontási határa 0,2 µm.

Mikroorganizmusok színezése- módszerkészlet a mikroorganizmusok szerkezetének és morfológiájának tanulmányozására tiszta kultúrákból vagy a vizsgált anyagból készült készítmények mikroszkópos vizsgálata során.

A fix baktériumok jobban festenek, mint az élők, mivel az élő sejt sejtfala és citoplazmatikus membránja korlátozza a festék behatolását.

A színes készítmény elkészítése több lépésből áll:

1) kenet készítése;

2) a kenet szárítása;

3) kenetrögzítés;

4) színezés;

5) szárítás.

Tiszta üveglemezeken kenetet készítünk, melynek közepére egy kis vizet csepegtetünk, és bakteriológiai hurok segítségével belehelyezzük a vizsgálandó anyagot. Az anyagot egyenletes vékony rétegben kenjük az üvegre, a kenet mérete 1-2 cm 2 .

A gyógyszert általában szobahőmérsékleten szárítják levegőn. A száradás felgyorsítása érdekében a kenet meleg levegőáramban, magasan az égő lángja felett melegíthető.

A megszáradt kenetet fixálásnak vetjük alá, melynek során a kenetet az üveghez rögzítjük (rögzítjük), és a mikrobák érzékenyebbé válnak a festődésre. Számos módja van a javításnak. A legegyszerűbb és leggyakoribb a hőrögzítés - az égő lángján való melegítés (a gyógyszert többször az égő lángjának legforróbb részén keresztül hajtják végre). Bizonyos esetekben folyadékokkal történő rögzítést alkalmaznak (etil- vagy metil-alkohol, aceton, egyenlő térfogatú alkohol és éter keveréke - Nikiforov szerint).

Rögzítés után a kenet foltosodik. A készítményre felvitt festék mennyiségének olyannak kell lennie, hogy a kenet teljes felületét lefedje. A festési időszak végén (2-5 perc) a festéket lecsepegtetjük, és a készítményt vízzel lemossuk.

Vannak egyszerű, összetett és eltérő módszerek a mikrobák megfestésére. Egyszerű színezéssel általában egy festéket használnak, leggyakrabban vörös - bíbor vagy kék - metilénkék. A bíbor szín gyorsabb (1-2 perc), a metilénkék - lassabban (3-5 perc). A fukszint tömény karbololdat (Ziel's fuchsin) formájában állítják elő, amely nagyon ellenálló és több hónapig festhető. A metilénkéket előzetesen telített alkoholos oldatban készítik, amely stabil és hosszú ideig tárolható.

A mikrobiológiai gyakorlatban használt színezékek fő típusai:

A két vagy több festéket alkalmazó komplex festési módszerek értékes módszerek a fertőző betegségek mikrobiológiai diagnosztikájában.

A Gram-festés mechanizmusa és lépései

1. Vigyen fel karbol-alkoholos enciánibolya oldatot egy rögzített tamponra. 1 perc expozíció után folytassa a 2. lépéssel.

2. Alkalmazza a Lugol-oldatot 1-2 percig (jód).

3. Színtelenítse etil-alkohollal 30-60 másodpercig. amíg a festék lila csíkjai meg nem szűnnek kijönni.

4. Lehetőség van a kenet további vízzel történő öblítésére is.

5. Fejezze be a fukszin vizes oldatával 1-2 percig.

6. Öblítse le vízzel, szárítsa meg és mikroszkóppal.

A Gram-pozitív baktériumok sötétlilára, a Gram-negatív baktériumok vörösre festődnek.