Окраска по граму. Окрашивание микропрепаратов

Все известные бактерии по способности окрашиваться по методу Грама делятся на положительных и отрицательных. Это разделение зависит от особенностей строения и окраски их клеточной стенки.

Метод позволяет разделить все виды в зависимости от плотности строения наружной оболочки клетки микроорганизма на:

более устойчивых к воздействию окружающей среды, влиянию антибиотиков;
менее устойчивых.

Первым ученым, предположившим, что некоторые методы, ранее используемые только в ботанике, могут использоваться в микробиологии, был Роберт Кох.

В 1884 г. Кристиан Грам, датский биолог, специализирующийся на окраске тканей, впервые попробовал метод дифференцирующей окраски.

Открытие позволило разделить все существующие виды микроорганизмов на грамположительные и грамотрицательные, что послужило толчком для новой ступени развития науки в области микробиологических исследований. Это также дало возможность выявлять устойчивость патогенных видов к лекарственным препараты, предугадывать их поведение, а что самое главное – разрабатывать антибиотики нового поколения, способные победить болезнь.

Строение клеточной стенки

Оболочка любой бактерии состоит из специального вещества – муреина. Его молекула представляет собой цепи полисахаридов, расположенных параллельно. Полисахариды, в свою очередь, связаны между собой цепями аминокислот, расположенных перекрестно.

Данная связь обуславливает крепкость, упругость оболочки, ее способность держать форму. Своеобразная плетеная сетка является защитой внутреннего слоя микроорганизма от действия разрушающих факторов, препятствует попаданию внутрь воды. При этом просветы между цепочками позволяют клетке поглощать питательные вещества, словно поры.

У положительных по Граму микроорганизмов оболочка толще, прочнее, что обусловлено включением в ее состав белка.

У отрицательных видов строение клеточной оболочки значительно сложнее, что позволяет ей быть защищенной от действия таких сред, как слюна, желудочный сок, другие жидкости с содержащимся в них лизоцимом – ферментом, обладающим антибактериальными свойствами. Снаружи более тонкая оболочка окружена пленкой из липидов и полисахаридов – гладким поверхностным слоем.

Сущность метода Грама

Основой метода Грама является принцип разделения бактерий на микроорганизмы со знаками «плюс» и «минус» по Граму, основываясь на разном химическом составе клеточных стенок микроорганизмов.

Для определения грамположительных и грамотрицательных бактерий препарат, нанесенный на стекло тонким равномерным слоем, вначале фиксируют с помощью нагревания над горелкой. Затем окрашивают анилиновым красителем – метиловым фиолетовым. После чего фиксируют йодом, дают подсохнуть и смывают при помощи спирта.

Грамположительные (Грам +) виды приобретают ярко-синюю окраску.
Грамотрицательные (Грам –) бактерии обесцвечиваются.

Заключающим этапом является окрашивание препарата контрастным красителем красного цвета, который позволяет получить грамотрицательные микроорганизмы красного или розового цвета. Это обусловлено тем, что краситель не может проникнуть в клетку из-за толстого ее внешнего слоя, окрашивая только поверхность.

Мертвые микробы приобретают более яркую окраску, по сравнению с живыми.

Характеристика бактерий, положительных по Граму

Большинство грамположительных бактерий являются патогенными для человека. Это возбудители опасных заболеваний:

Стрептококк (Streptococcus), вызывающий тонзиллиты, фарингиты, ревматизм.
Стафилококк (Staphylococcus) – возбудитель заражения крови, кожных гнойных заболеваний.
Листерия (Listeria), вызывающая листериоз – воспаление мозга.
Бациллы (Bacillus) – возбудители токсикоинфекций, сибирской язвы.
Клостридии (Clostridium), вызывающие ботулизм, столбняк, газовую гангрену.

Два последних вида являются спорообразующими анаэробами, остальные не могут образовывать спор. Некоторые способны окрашиваться только в фазе активного роста.

Отрицательные бактерии по Граму

Это полностью обесцвечивающиеся после промывки спиртом бактерии; в результате повторной окраски сафранином приобретают розовый или ярко-красный цвет. Они более устойчивы к антителам, чем виды Грам +.

К грамотрицательным относятся в основном бактерии условно патогенные, способные вызвать воспалительные процессы и иммунный ответ в организме человека при определенных условиях. Их клеточная оболочка, состоящая из липополисахаридного слоя, вызывает синтез цитокинов, что способствует увеличению токсинов в месте локализации воспаления. Впоследствии токсины, разнесенные с кровотоком, отравляющим действием вызывают сильнейшие симптомы интоксикации.

Важная роль метода Грама в диагностике заболеваний

Метод, позволяющий отличить положительные бактерии по Граму и отрицательные, незаменим при исследовании человеческого биологического материала на выявление бактериальной инфекции.

Материал, используемый для диагностики:

мокрота позволяет классифицировать состав микрофлоры носоглотки, обнаружив возбудителей заболеваний;
в анализе кала обнаруживают токсины, вырабатываемые грамположительными видами;
мазок из влагалища дает возможность посчитать процент грамотрицательных и положительных микробов для диагностики бактериальных вагинитов;
плевральная, синовиальная, перинатальная жидкости также являются достаточно информативными.

Метод, внедренный Кристианом Грамом, позволил науке далеко продвинуться в знаниях о строении микробов, об их защитных механизмах. Он позволил ввести самую верную систему разделения бактерий на положительные и отрицательные, используемую до сих пор для диагностики инфекционных болезней.

Наиболее широко в микробиологической практике применяется сложный метод окраски по Граму (предложен впервые в 1884 г. датским ученым X. Грамом). Метод является одним из важнейших опознавательных признаков при определении вида бактерий.

Сущность метода окраски по Граму заключается в том, что все бактерии по способности окрашиваться красителями (генциан-виолет или кристалл-виолет с йодом) делятся на две группы. К одной относятся бактерии, в клетках которых комплекс, образуемый указанными красителями, сохраняется после обработки их спиртом. Такие клетки в результате окраски приобретают темно-фиолетовый цвет и получили название грамположительных (грам+). Например, спорообразующие бактерии родов - Bacillus, Clostridium, среди бесспоровых – Lactobacillus, Micrococcus, Staphylococcus, Sarcina, Leuconostok и др.

К другой группе относятся виды, которые не способны удерживать красящий комплекс и обесцвечиваются при обработке спиртом. Их называют грамотрицательными (грам-). К числу их принадлежат многие виды неспорообразующих палочковидных бактерий, в т.ч. роды Pseudomonas, Escherichia, Salmonella, Proteus и др.

Способность или неспособность клеток удерживать красящий комплекс в настоящее время связывают с химическим составом и структурой клеточных стенок бактерий. В оболочках грам + бактерий содержится больше гликопептида муреина, полисахаридов и тейхоевые кислоты. Они имеют достаточно плотную многослойную структуру. В клетках грам+ бактерий генциан-виолет и йод образуют прочное соединение с цитоплазмой, которое не извлекается спиртом. Они сохраняют фиолетовый цвет генциан-виолета и при дополнительном окрашивании фуксином Пфейффера.

Оболочки грам- бактерий однослойны, в них отмечено высокое содержание липидов в виде липопротиидов и липополисахаридов. Грам- бактерии при обработке спиртом обесцвечиваются, т.к. у них генциан-виолет не фиксируется в цитоплазме. При дополнительном окрашивании фуксином клетки бактерий окрашиваются только в бледнорозовый цвет.

Грам+ отличаются от грам- не только своим отношением к окраске, но и рядом биологических свойств и особенностей. Большинство грам+ видов обладают повышенной устойчивостью к обезвоживанию, термической обработке, радиоактивным и другим типам излучений. В тоже время грам-бактерии более устойчивы к действию щелочей и протеолитических ферментов, а также антибиотиков.

Окраску по Граму используют при определении степени загрязнения пищевых продуктов посторонней, в т.ч. условно патогенной (кишечная группа) микрофлорой, для выяснения диапазона действия антибиотиков и др. целей. Следует учитывать, что некоторые виды бактерий будучи грам+ в молодом возрасте, в старых культурах не все интенсивно красятся по Граму. Поэтому для окраски следует брать односуточные или двухсуточные культуры и, кроме того, пользоваться для сравнения контрольными культурами (стандартами), отношение которых к окраске по Граму заранее известно.

Окраска по Граму проводится следующим образом:

1. На одном предметном стекле готовят три мазка из бактериальных культур: заведомо известной Грамположительной, исследуемой и заведомо известной Грамотрицательной.

2. Мазки высушивают и фиксируют пламенем.

3. Окрашивают карболовым раствором генциан-виолета в течение 1-2 мин.

4. Краску удаляют стряхиванием, на мазки наносят раствор Люголя (раствор J и КJ) и выдерживают 1-2 мин. до почернения мазка.

5. Сливают раствор Люголя и на препарат наносят несколько капель 96% спирта и слегка покачивая стекло, выдерживают его до осветления мазка. (20-30 сек).

Препарат немедленно промывают водой. От обработки мазка спиртом зависит результат всего окрашивания: при недостаточной обработку все бактерии сохраняют окрашивание, при излишней – все клетки обесцвечиваются.

6. Дополнительно окрашивают препарат фуксином Пфейффера (разведенный фуксин) в течение 2 мин.

7. Краску смывают, препарат подсушивают и смотрят с иммерсионным объективом 90х.

Если препарат приготовлен правильно, то в поле зрения видны грам + темно-фиолетовые клетки и рядом с ними хорошо различаются бледно-розовые грам- клетки.

Окраска по Граму – основной метод окраски в бактериологии. С окраски по Граму начинается описание морфологических свойств. Такое значение этого метода обуславливается тем, что окраска бактериальной клетки по Граму зависит от типа строения её клеточной стенки и, соответственно, принадлежности к отделу Firmicutes или Gracilicutes – первого этапа идентификации любого вида в бактериологии. Окраска по Граму осуществляется в четыре этапа.
А. На первом этапе фиксированный мазок окрашивается генциановым фиолетовым.

1. Окрашивание продолжается 1 – 2 минуты.
2. И грамположительные и грамотрицательные бактерии окрашиваются этой краской в синий цвет.
Б. На втором этапе мазок обрабатывается раствором Люголя, который формирует с генцианвиолетом красящий комплекс, локализующийся на цитоплазматической мембране.
1. Обработка раствором Люголя продолжается 1 – 2 минуты.
2. И грамположительные и грамотрицательные бактерии на этом этапе остаются синими.
В. На третьем этапе мазок обесцвечивается спиртом.
1. Обесцвечивание спиртом продолжается примерно 20 секунд с последующим обильным промыванием водой.
2. Грамположительные бактерии за это время не успевают обесцветиться и остаются синими, а грамотрицательные, вследствие более тонкого слоя пептидогликана, препятствующего вымыванию спиртом красящего комплекса, обесцветиться успеют и, следовательно, станут бесцветными.
Г. На четвертом этапе мазок окрашивается водным фуксином или другой красной краской – сафранином.
1. Докраска красной краской продолжается 1 – 2 минуты. Причем, этот этап лучше продлить подоль-ше, так как после обесцвечивания бактериальная клеточная стенка воспринимает краску хуже, чем обычно.
2. Грамположительные бактерии остаются синими, так как они уже окрашены более темной краской а грамотрицательные, которые на предыдущем этапе обесцветились, на этом этапе окрашиваются в красный цвет. Д. Грамположительные бактерии составляют меньшую часть тех бактерий, которые изучает меди-цинская микробиология. Ниже приводятся основные (этот перечень будет позже добавлен неспорооб-разующими анаэробами).
1. Грамположительными являются большинство кокков (кроме нейссерий): стафилококки, стрепто-кокки и пневмококки, энтерококки.
2. Среди палочек грамположительными являются листерии, бактерии актиномицетного ряда (актино-мицеты, микобактерии, коринебактерии), спорообразующие палочки (бациллы и клостридии).
Е. Большинство бактерий, имеющих медицинское значение, грамотрицательные. Лишь по отношению к микоплазмам не корректно говорить об их грамотрицательности (хотя по Граму они окрашивались бы в розовый цвет – если бы их так окрашивали, так как на практике этот метод в изучении микоплазм не применяется). Дело в том, что грамоложительные и грамотрицательные бактерии отлича-ются друг от друга типом клеточной стенки (прежде всего – количеством содержащегося в ней пепти-догликана), а у микоплазм клеточной стенки с содержанием пептидогликана нет.
1. Из кокков грамотрицательные – нейссерии.
2. Грамотрицательными являются большинство палочек (собственно все, за исключением перечисленных выше грамположительных).
3. Клеточную стенку грамотрицательного типа имеют также спирохеты.

(или метод Грама) — эмпирически выведенный метод различения бактерий с помощью окрашивания их определенным методом на две большие группы: Грамположительные и Грамотрицательные), различающихся химическими и физическими свойствами их клеточной стенки.

Этимология

Метод называется в честь его изобретателя, датского ученого Ганса Христиана Грама (1853-1938), который разработал этот метод в 1884 году чтобы различить бактерии Pneumococcus и Klebsiella pneumoniae.

Использование

Окраска по Граму — одна из самых полезных красящих процедур в лабораторных исследованиях в микробиологии. Процедура широко используется как инструмент для различения Грамм-отрицательных и Грам-положительных бактерий, обычно являются первым шагом в определении идентичности специфического бактериального образца.

В медицине окрашивания по Граму выполняется при анализе крови или биопсии, когда подозревается инфекция. Этот метод гораздо быстрее, чем культура, и особенно важен, когда определение типа инфекции необходимо для прогноза и выбора метода лечения. Например, при диагностике цереброспинальной жидкости менингитом и жидкости суставов на септический артрит.

При анализе, например, Коки и спороносные формы бактерий, а также дрожжи — грам-положительные и окрашиваются в иссиня-черный (темно-синий) цвет, большинство других бактерий — грамотрицательные и окрашиваются в красный цвет, ядра клеток эукариот приобретают ярко красного цвета, а цитоплазма — розового.

Техника проведения окрашивания

Окраска по Граму относится к сложному способу окрашивания, когда на мазок влияют двумя красителями, из которых один является основным, а другой — дополнительным. Кроме красящих веществ при сложных способах окраски применяют обезбарвлюючи вещества: спирт, кислоты и др. Для окраски по Граму чаще используют красители трифенилметанового группы: генциановый, метиловый фиолетовый или кристалл виолет. Грам-положительные (грамм (+)) микроорганизмы дают прочное соединение с указанными красителями и йодом. При этом они не обесцвечиваются при воздействии на них спиртом, в результате чего при дополнительном окраске фуксином Грамм (+) микроорганизмы не меняют сначала присоединен фиолетовый цвет.

Грамотрицательные (грамм (-)) микроорганизмы образуют с основными красителями и йодом соединения, легко разрушается под действием спирта. В результате микробы обесцвечиваются и потом окрашиваются фуксином, приобретая красного цвета.

Подготовка материала для окраски

Материал исследуемого распределяют тонким слоем по поверхности хорошо обезжиренного стекла. Приготовленный мазок высушивают на воздухе и после полного высыхания фиксируют.

Фиксация

При фиксации мазок закрепляется на поверхности стекла, и поэтому при дальнейшем окрашивании препарата клетки не смываются. Кроме того, убиты микробные клетки окрашиваются лучше, чем живые. Различают физический способ фиксации, в основу которого положена действие высокой температуры на клетку, и химические способы, предусматривающие применение химических средств, вызывающих коагуляцию белков цитоплазмы.

Физический способ фиксации Стекло с препаратом берут пинцетом и плавным движением проводят 2-3 раза над верхней частью пламени горелки. Весь процесс фиксации должен занимать не более 2 с. Надежность фиксации проверяют таким приемом: свободную от мазка поверхность стекла прикладывают к тыльной поверхности левой кисти. При правильной фиксации стекло должно быть горячим, но не вызывать ощущение ожога (70-80 ° С).

Химический способ фиксации Для фиксации мазков применяют метиловый спирт, ацетон, смесь Никифорова (смесь этилового спирта 96% и наркозного эфира в соотношении 1: 1), жидкость Карнуа (этилового спирта 96% — 60%, хлороформа 30%, ледяной уксусной кислоты 10 %). Стекло с высушенным мазком погружают в стакан с фиксирующей веществом на 10-15 минут и затем высушивают на воздухе.

Процесс окрашивания

На фиксированный мазок наливают один из основных красителей на 2-3 минуты. Чтобы избежать осадка красят через фильтровальную бумагу.
Сливают краску, аккуратно удаляют фильтровальную бумагу. Мазок заливают на 1-2 мин раствором Люголя или йодистым раствором, по Граму (водный раствор йодида калия и кристаллического йода в соотношении 2: 1) в почернение препарата.
Раствор сливают, мазок прополаскивают 96 ° этиловым спиртом или ацетоном, наливая и сливая его, пока мазок НЕ обесцветится и жидкость стекает, не станет чистой (примерно 20-40-60 секунд).
Тщательно промывают стекла в проточной или дистиллированной воде 1-2 мин.
Для выявления грамотрицательных бактерий препараты дополнительно окрашивают фуксином или сафранина (2-5 мин).
Промывают в проточной воде и высушивают фильтровальной бумагой.

Практикум: Микроскопическое изучение живых (нативных) и окрашенных микробов.

Микроскопический метод в микробиологии. Методические основы.

Микроскопия в световом оптическом микроскопе.

Световой микроскоп состоит из механической и оптической части. Механическая часть микроскопа - это штатив, состоящий из основания и колонки, к которой прикреплены тубус и предметный столик. В колонке имеются две винтовые системы для установки тубуса. Оптическая часть микроскопа состоит из осветительного аппарата, объективов и окуляров. Осветительный аппарат расположен под предметным столиком. В большинстве микроскопов свет отражается от зеркала и, пройдя через линзы конденсора, фокусируется в плоскости препарата. В современных микроскопах освещение достигается с помощью вмонтированного в микроскоп источника света. Объективы представляют собой систему линз в металлической оправе. Передняя (фронтальная) линза - самая маленькая. От нее главным образом зависит увеличение микроскопа. Расположенные за ней линзы называются коррекционными, так как они предназначены для устранения недостатков оптического изображения. При микроскопии объектив погружают в каплю масла, поэтому объектив называют иммерсионным объективом (лат. immercio - погружение), а масло - иммерсионным маслом. Иммерсионный объектив требует особо осторожного обращения. Фронтальная линза имеет настолько короткое фокусное расстояние до исследуемого объекта, что опускать объектив нужно медленно, глядя сбоку, чтобы не раздавить препарат, что связано с порчей линзы. Окуляры имеют две линзы: верхняя называется глазной, а нижняя - собирательной. Окуляры обозначают по тому увеличению, которое они дают, например: х7, х10, х15 и т.д. Предел разрешения оптического микроскопа равен 0,2 мкм.

Окраска микроорганизмов - комплекс методов изучения структуры и морфологии микроорганизмов при микроскопии препаратов, приготовленных из чистых культур или исследуемого материала.

Фиксированные бактерии окрашиваются лучше живых, так как клеточная стенка и цитоплазматическая мембрана живой клетки ограничивают проникновение в нее красителя.

Приготовление окрашенного препарата включает ряд этапов:

1) приготовление мазка;

2) высушивание мазка;

3) фиксацию мазка;

4) окраску;

5) высушивание.

Мазок готовят на чистых предметных стеклах, на середину которых наносят небольшую каплю воды и в нее с помощью бактериологической петли помещают исследуемый материал. Материал распределяют на стекле равномерным тонким слоем, размер мазка -1-2 см 2 .

Препарат обычно высушивают при комнатной температуре на воздухе. Для ускорения высушивания допускается подогревание мазка в струе теплого воздуха высоко над пламенем горелки.

Высушенный мазок подвергается фиксации, при которой мазок прикрепляется к стеклу (фиксируется), а микробы становятся более восприимчивыми к окраске. Способов фиксации много. Наиболее простой и распространенный - фиксация жаром - нагревание на пламени горелки (препарат проводят несколько раз через наиболее горячую часть пламени горелки). В ряде случаев прибегают к фиксации жидкостями (этиловый или метиловый спирт, ацетон, смесь равных объемов спирта и эфира - по Никифорову).

После фиксации мазок окрашивают. Количество краски, наносимое на препарат, должно быть таким, чтобы покрыть всю поверхность мазка. По истечении срока окрашивания (2-5 мин.) краску сливают и препарат промывают водой.

Существуют простые, сложные и дифференциальные способы окрашивания микробов. При простой окраске обычно употребляют одну краску, чаще всего красную - фуксин, или синюю - метиленовый синий. Фуксин красит быстрее (1-2 мин.), метиленовый синий - медленнее (3-5 мин.). Фуксин приготовляют в виде концентрированного карболового раствора (фуксин Циля), очень стойкого и пригодного для окраски в течение многих месяцев. Метиленовый синий приготовляется заранее в насыщенном спиртовом растворе, который стоек и может долго храниться.

Основные виды красителей, которые применяются в микробиологической практике:

Сложные способы окраски, при которых применяются два или более красителя, являются ценными методами, используемыми в микробиологической диагностике инфекционных болезней.

Механизм и этапы окраски по Граму

1. На фиксированный мазок нанести карболово-спиртовой раствор генцианового фиолетового. Через 1 минуту экспозиции перейти к п.2.

2. Нанести раствор Люголя на 1-2 мин (йод).

3. Обесцветить этиловым спиртом в течение 30-60 сек. до прекращения отхождения фиолетовых струек красителя.

4. Возможно дополнительно промыть мазок водой.

5. Докрасить водным раствором фуксина в течение 1-2 мин,

6. Промыть водой, высушить и микроскопировать.

Грамположительные бактерии окрашиваются в темно-фиолетовый цвет, грамотрицательные - в красный.